Na+k+  ——ATP酶測試盒微量法

本公司所有產(chǎn)品僅供科學(xué)實驗，不做其他科學(xué)實驗外的使用！
商品屬性：

測定意義：

Na+K+- ATP 酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細(xì)胞中，可催化 ATP 水解生成 ADP 和無機(jī)磷。

測定原理：

Na+K+-ATP 酶分解 ATP 生成 ADP 及無機(jī)磷，通過測定無機(jī)磷的量來確定 ATP 酶活性。

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、

研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 100mL ×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 6mL 蒸餾水充分混勻待用；用不完的試劑分裝

后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：液體 2mL×1 瓶，4℃保存。

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。用時加入 3mL 蒸餾水， 4℃保存。

試劑五：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時加入 25mL 蒸餾水，溶解后 4℃保存一周。

試劑六：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時加入 25mL 蒸餾水，溶解后 4℃保存一周。

試劑七：液體 25mL×1 瓶，室溫保存。

試劑八：10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保存。

0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將試劑八 20 倍稀釋，即取 0.1mL 試劑八加 1.9mL 蒸餾水

充分混勻。

定磷劑的配制：按 H2O: 試劑五:試劑六:試劑七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應(yīng)為淺

黃色。若無色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

樣品酶液的制備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量

（104個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，

加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟:

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 660nm，蒸餾水調(diào)零。

2、酶促反應(yīng)（在 EP 管中加入下列試劑）

對照管 測定管

試劑一（μL） 65 45

試劑二（μL） 60 60

試劑三（μL） 20

樣本 （μL） 100

混勻，37℃（哺乳動物）或 25℃（其他物種）準(zhǔn)確水浴 10min

試劑四（μL） 25 25

樣本 （μL） 100

混勻，8000g，25℃離心 10min，取上清液

3、定磷（在 EP 管或 96 孔板中加入下列試劑）

空白管 標(biāo)準(zhǔn)管 對照管 測定管

0.5μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液（μL） 20

上清液（μL） 20 20

蒸餾水（μL） 20

定磷試劑（μL） 200 200 200 200

混勻，室溫放置 30min，在 660nm 處，記錄各管吸光值。

注意：

1、由于每一個樣都必須做對照，本試劑盒 100 管保證測 48 份 Na+K+-ATP 酶。

2、此法具有微量、靈敏、快速的特點。所以對測定所用試管要求嚴(yán)格無磷。

3、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。

計算

1、血清（漿）Na+K+- ATPase 活力的計算:

定義：每小時每毫升血清（漿）中 Na+K+- ATP 酶分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個

酶活力單位。

Na+K+-ATP 酶活力（μmol/h/mL）=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷V 樣÷T=7.5×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 Na+K+ATPase 活力的計算：

（1）按蛋白濃度計算：

定義：每小時每毫克組織蛋白中 Na+K+- ATP 酶分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個酶

活力單位。

Na+K+-ATP 酶活力(μmol/h /mg prot)=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管

-A 空白管）÷（Cpr×V 樣）÷T =7.5×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

定義：每小時每克組織中Na+K+-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。

Na+K+-ATP 酶活力(μmol/h /g 鮮重)=[ C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管

-A 空白管）÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=7.5×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

定義：每小時每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞中 Na+K+-ATP 酶分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。Na+K+-ATP 酶活力(μmol/h /104

cell) =[ C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.015×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）

C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/mL；V 總：酶促反應(yīng)總體積，0.25mL；V 樣：加入樣本體

積，0.1mL ；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，1/6 小時；Cpr：樣本蛋白質(zhì)

濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

生化試劑盒的使用注意事項：

選擇合適的試劑盒：根據(jù)實驗?zāi)康暮蜋z測對象選擇合適的試劑盒，確保實驗的準(zhǔn)確性和可靠性。

嚴(yán)格遵循說明書：按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作，避免誤用或浪費。

注意保存條件：按照試劑盒的保存條件進(jìn)行妥善保存，避免陽光直射、高溫或潮濕等不利因素。

控制實驗條件：在實驗過程中嚴(yán)格控制實驗條件，如溫度、時間、pH值等，以確保實驗結(jié)果的穩(wěn)定性。

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